ВТБ Дебетовая карта
Методические указания по методам контроля МУК 4.1.1247-03 Определение остаточных количеств бентазона в семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Методические указания по методам контроля МУК 4.1.1247-03 Определение остаточных количеств бентазона в семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

             

     МУК 4.1.1247-03

 

 

     

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

 

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

      

Определение остаточных количеств бентазона в семенах и масле сои методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии

     

     

Дата введения 2003-07-01

УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 16 марта 2003 г.

 

 

 1. Вводная часть

Фирма-производитель: Август.

 

Торговое наименование: Корсар.

 

Действующее вещество: бентазон.

 

Структурная формула:

 

 

3-изопропил-1Н-2,1,3-бензотиадиазин-4(3Н)-он 2,2-диоксид (IUPAC)

 

3-(1-метилэтил)-1Н-2,1,3-бензотиадиазин-4(3Н)-он 2,2-диоксид (С.А.)

 

Брутто формула: C
H
N
O
S.
 

Молекулярная масса: 240,3.

 

Бесцветное кристаллическое вещество.

 

Температура плавления: 139,4-141 °С.

 

Давление паров при 20 °С: 0,17 мПа.

 

Коэффициент распределения н-октанол/вода:
0,77 (рН 5), - 0,46 (рН 7), - 0,55 (рН 9).
 
Константа Генри 7,167
10
Па·м
·
моль
(расчетное значение).
 
Растворимость (г/л) при 20
°
С: ацетон - 1387, дихлорметан - 206, метанол - 1061, этилацетат - 582, н-гептан - 0,5
10
мг/л. Растворимость в воде (мг/л, 20
°
С): 570 (рН 7).
 

Вещество очень устойчиво к гидролизу, как в кислой, так и в щелочной средах, рКа 3,3 (24 °С). Разлагается на свету.

 

Гигиенические нормативы. ВМДУ бентазона в сое (семена и масло) - 0,1 мг/кг.

 

Область применения препарата: Корсар - селективный контактный гербицид. Адсорбируется главным образом листвой. Используется для защиты зимних и весенних зерновых, бобовых и других культур.

 

 

 2. Методика определения бентазона в семенах и масле сои методом ВЭЖХ

 

      

2.1. Основные положения

     

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении бентазона методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов этилацетатом или водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.

 

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1.

 

Таблица 1

     

Метрологическая характеристика метода

 

Объект

анализа

Предел обнаружения, мг/кг (л)

Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (л)

Среднее значение определения, % (для каждого объекта
24)
 

Относительное стандартное отклонение

,%
 
Доверительный интервал среднего,
24,
0,95
 

Семена сои

0,01

0,01-0,1

86,2

7,60

6,08

Масло сои

0,02

0,02-0,2

87,6

7,20

5,76

 

     

     

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

 

 

 2.2. Реактивы и материалы

 

Ацетон, чда

 

ГОСТ 2603-79

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или хч

 

ТУ 6-09-3534-87

Бумажные фильтры "красная лента"

 

ТУ 6.091678-86

Вода бидистиллированная, деионизированная

 

ГОСТ 6709-72

Бентазон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%

 

 

Дихлорметан, хч

 

ТУ 2631-019-44493179-98

Калий углекислый, хч

 

ГОСТ 4221-76

Калий фосфорно-кислый 2-замещенный 3-водный, чда

 

ГОСТ 2493-75

Калия перманганат

 

ГОСТ 20490-75

Кальция хлорид, хч

 

ГОСТ 4161-77

Кислота ортофосфорная, чда 85%-ный раствор, хч

 

ГОСТ 6552-80

Кислота серная, хч

 

ГОСТ 4204-77

Натрий серно-кислый безводный, ч, свежепрокаленный

 

ГОСТ 4166-76

Натрия гидроксид, хч

 

ГОСТ 4328-77

Натрий двууглекислый

 

ГОСТ 83-79

н-Гексан, хч свежеперегнанный

 

ТУ 2631-003-05807999-98

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,02 М ортофосфорная кислота (40:60, по объему)

 

Силикагель 60 (40-63
) (имп., производства Германии или Чехии)
 

 

 

Стекловата

 

 

Фосфора пентоксид, ч

 

МРТУ 6-09-5759-69

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (50:50, по объему)

 

 

Элюент N 2 для колоночной хроматографии:

смесь гексан-этилацетат (20:80, по объему)

 

 

Этиловый эфир уксусной кислоты, чда

 

ГОСТ 22300-76

 

 

      

     

2.3. Приборы и посуда

 

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный

 

 

Колонка Symmetry - С18 (250
4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная
 

 

 

Предколонка Waters Symmetry - C18 (20
3,9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA)
 

 

 

Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные

 

ГОСТ 34104-80Е

Установка ультразвуковая "Серьга"

 

ТУ 3.836.008

Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ

 

ТУ 1-01-0593-79

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М или аналогичный

 

ТУ 25-11-917-74

Бидистиллятор

 

 

рН-метр универсальный ЭВ-74

 

ГОСТ 22261-76

Насос водоструйный

 

МРТУ 42 861-64

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС

 

ГОСТ 10384-72

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС

 

ГОСТ 10384-72

Воронки лабораторные В-75-110

 

ГОСТ 25336-82

Воронки делительные на 100 и 250 см
 

ВД-3-100 (250)

 

ГОСТ 8613-75

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 см
 

 

ГОСТ 1774-74

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 см
 

 

ГОСТ 1770-74

Пипетки на 1, 2, 5, 10 см
 

 

ГОСТ 22292-74

 

 

      

     

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы семян хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С, перед проведением анализа их измельчают на лабораторной зерновой мельнице.

 

 

 2.5. Подготовка к определению

     

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташем (на 1 л ацетона 10 г KМnО
и 2 г K
СО
). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
 

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 ч.

 

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005М раствора ортофосфорной кислоты 2 г 98% (или 2,24 г 87%) кристаллической Н
РО
помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0,5 М раствора K
НРО
114 г кристаллического K
НРО
О помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют при перемешивании в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки, 0,25 М раствор K
НРО
готовят разбавлением в 2 раза 0,5 М раствора. Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 400 мл ацетонитрила с 600 мл 0,02 М ортофосфорной кислоты в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 500 мл н-гексана и 500 мл этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 200 мл н-гексана и 800 мл этилацетата.
 

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску бентазона (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-0,02 М ортофосфорная кислота [40:60, по объему]). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

 

Внимание! Бентазон в растворах достаточно быстро разлагается под воздействием света, поэтому следует избегать длительного нахождения проб и стандартных растворов на свету.

 

При определении полноты извлечения для внесения в образец используют растворы бентазона, приготовленные из стандартного раствора последовательным разбавлением ацетонитрилом.

 

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация бентазона в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации бентазона в градуировочном растворе (мкг/мл).

 

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан-этилацетат (20:80, по объему) и 30 мл смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

 

2.5.7. Проверка хроматографического поведения бентазона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора бентазона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 50 мл элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п.2.5.3) и анализируют на содержание бентазона по п.2.6.4.

 

Фракции, содержащие бентазон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п.2.6.4. Рассчитывают содержание бентазона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

 

Примечание: параметры удерживания бентазона и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

 

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

 

 2.6. Проведение определения

     

2.6.1. Определение бентазона в семенах сои

Навеску измельченных на лабораторной мельнице семян сои, массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 40 мл этилацетата и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды с 30 мл этилацетата. Объединенный экстракт концентрируют на вакуумном ротационном испарителе до объема 25-30 мл при температуре не выше 40
°
С, переносят в делительную воронку объемом 100 мл, бентазон экстрагируют трижды 0,25 М раствором K
НРО
, порциями по 40 мл*. Экстракт промывают дважды 50 мл гексана (верхний органический слой отбрасывают) и дважды 50 мл хлористого метилена (нижний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз по 2-3 мин. Водный раствор подкисляют 2М Н
РО
(~30 мл) до рН 3 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют хлористым метиленом трижды по 25 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (3 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40
°
С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3**.
 

___________________

* В процессе экстракции бентазона из этилацетатного раствора возможно изменение рН водного экстракта вследствие частичного гидролиза этилацетата. Во избежание потерь определяемого компонента следует после экстракции довести рН раствора до 9 путем добавления 0,5 М раствора K
НРО
(контроль осуществлять рН-метром).
 

** В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п.2.6.3) дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.

 

2.6.2. Определение бентазона в масле сои

Навеску масла, массой 10 г растворяют в 60 мл гексана и экстрагируют бентазон 50 мл системы ацетон-вода (в соотношении 1:1) в делительной воронке объемом 100 мл. Смесь встряхивают в течение 2 мин, нижний водно-ацетоновый слой отделяют*. Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт помещают в морозильную камеру с температурой -18
°
С на 1 час, после чего фильтруют через бумажный фильтр (красная лента) и упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40
°
С до полного удаления ацетона (объем ~50 мл). Водный остаток переносят в делительную воронку объемом 250 мл, дважды промывают гексаном, порциями по 50 мл, встряхивая смесь в течение 2 мин и отбрасывая верхний органический слой. Добавляют к водному раствору 50 мл 0,5 М раствора K
НРО
. Экстракт промывают дважды в делительной воронке хлористым метиленом, порциями по 50 мл, встряхивая смесь в течение 2 минут и отбрасывая нижний органический слой. Водный раствор подкисляют 2 М Н
РО
(~30 мл) до рН 3 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют хлористым метиленом трижды по 25 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (3 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40
°
С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.2.6.3.
 

________________

* В случае образования сравнительно стойких эмульсий на стадии экстракции бентазона водным ацетоном для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта.

 

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п.2.6.1 и 2.6.2 экстрактов семян или масла сои, количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п.2.5.6). Промывают колонку 50 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Бентазон элюируют 60 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

 

2.6.4. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry - С18 (250
4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.
 

Температура колонки 30±1 °С.

 

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

 

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,02М ортофосфорная кислота в соотношении 40:60 (по объему).

 

Скорость потока элюента: 1 мл/мин

 

Рабочая длина волны 214 нм

 

Объем вводимой пробы 50 мкл

 

Время удерживания бентазона 12,2±0,2 мин

 

Линейный диапазон детектирования 0,1-2,00 мкг/мл

 

2.6.5. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание бентазона в образце семян или масла сои (
, мг/кг) вычисляют по формуле:
 

, где
 
- площадь пика бентазона в стандартном растворе, ед.адс
с;
 
- площадь пика бентазона в анализируемой пробе, ед.адс
с;
 
- объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
 
- навеска анализируемого образца, г;
 
- концентрация стандартного раствора бентазона, мкг/мл.
 

Содержание остаточных количеств бентазона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

 

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор бентазона 2 мкг/мл, разбавляют.

 

 

 3. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории"*, общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования.

 

           

 4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

 

 

 5. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Юзихин О.С., Короткова Н.В.

 

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений.