ГОСТ Р 53594-2009 Продукция животноводства и корма. Иммуноферментный метод определения синтетических анаболических стимуляторов роста.

ГОСТ Р 53594-2009 Продукция животноводства и корма. Иммуноферментный метод определения синтетических анаболических стимуляторов роста.

ГОСТ Р 53594-2009

Группа Р31

С14

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКЦИЯ ЖИВОТНОВОДСТВА И КОРМА

Иммуноферментный метод определения синтетических анаболических стимуляторов роста

Livestock products and feedstuffs. Immunoenzyme method of determination of the synthetic growth promoters

ОКС 11.220

65.120

Дата введения 2011-01-01

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 декабря 2009 г. N 906-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма, физиологические жидкости (моча), органы и ткани (мышцы, печень, глаза), а также шерсть животных и устанавливает иммуноферментный метод определения синтетических стимуляторов роста (метилтестостерона, 19-нортестостерона, дексаметазона, диэтилстильбестрола, тренболона, этинилэстрадиола и кленбутерола).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79* Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 245-76 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 334-73 Бумага масштабно-координатная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2652-78 Калия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4172-76 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5208-81 Спирт бутиловый нормальный технический. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 7269-79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести

ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия

ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия

ГОСТ 9968-86 Метилен хлористый технический. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Методы отбора проб

ГОСТ 29224-97* (ИСО 386-77) Посуда лабораторная стеклянная. Термометры жидкостные стеклянные лабораторные. Принципы устройства, конструирования и применения

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.

3.1.2 вспомогательный раствор: Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый для приготовления других типов растворов.

3.1.3 рабочий раствор: Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосредственно перед использованием и необходимый для выполнения процедуры анализа.

3.1.4 анаболик: Любая субстанция, способная поддерживать прирост мышечной ткани.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

ИФА - иммуноферментный анализ;

ОП - оптическая плотность;

АГ - антиген;

AT - антитела;

ФК - ферментный конъюгат;

ТБМЭ - трет-бутил-метиловый эфир;

ТМБ - 3, 3’, 5,5’-тетраметил-бензидин.

4 Характеристика метода

4.1 Иммуноферментный метод основан на измерении содержания синтетических анаболических стимуляторов роста в пробах с помощью непрямого твердофазного конкурентного ИФА рабочих растворов экстрактов исследуемых образцов.

4.2 Непрямой твердофазный конкурентный ИФА основан на способности синтетических анаболических стимуляторов роста взаимодействовать со специфичными AT в условиях конкуренции с белковым конъюгатом анаболика, нанесенным на поверхность лунок планшета, - твердофазным АГ.

4.3 Связавшиеся с твердой фазой AT выявляют путем измерения интенсивности окрашивания конечного продукта реакции: вторичных антивидовых AT, меченных пероксидазой хрена, с субстрат-хромогенной смесью.

Аналитический сигнал (регистрируемое значение ОП), измеряющий степень взаимодействия AT с АГ, обратно пропорционален массовой концентрации анаболика в рабочем растворе.

5 Прецизионность метода

5.1 Показатели прецизионности метода при доверительной вероятности

0,95, определенные в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2 и ГОСТ Р ИСО 5725-3, представлены в таблице 1.

Таблица 1


Определяемый компонент	Диапазон измерений, мкг/дм	Предел повторяемости , %	Предел промежуточной прецизионности , %	Границы относительной погрешности ,%
Кленбутерол	0,01-6,25	35	40	30
19-нортестостерон	0,0125-7,8125	35	40	30
Диэтилстильбестрол	0,0125-7,8125	30	35	30
Метилтестостерон	0,1-62,5	15	20	20
Тренболон	0,1-62,5	10	15	15
Этинилэстрадиол	0,1-62,5	15	20	20
Дексаметазон	0,1-62,5	30	35	30

5.2 Расхождение между результатами двух параллельных определений, полученными в условиях повторяемости, может превышать предел повторяемости

не более одного раза из двадцати.

5.3 Расхождение двух результатов анализа, полученных в условиях промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности (разное время, разные операторы, разное оборудование), может превышать значение предела промежуточной прецизионности

не более одного раза из двадцати.

6 Требования к условиям выполнения измерений

Измерения проводят при температуре окружающего воздуха (23±5) °С, атмосферном давлении (97±7) кПа, относительной влажности (65±15)%, с использованием переменного тока с частотой (50±5) Гц и напряжением в сети (220±10) В.

7 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений и вспомогательное оборудование:

- фотометр вертикального типа фотометрирования с диапазоном измерений ОП от 0 до 3 в комплекте с интерференционными светофильтрами для длин волн 450 и 620 нм;

- весы лабораторные с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0002 г;

- весы лабораторные с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,04 г;

- шкаф холодильный любого типа, обеспечивающий среднюю температуру в холодильной камере не выше 10 °С;

- камеру морозильную любого типа, обеспечивающую среднюю температуру в холодильной камере не выше минус 20 °С;

- дистиллятор любого типа;

- калькулятор любого типа с логарифмической функцией;

- рН-метр любой марки, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 3 до 10 ед. рН с погрешностью ±0,05 ед. рН;

- термометр жидкостный стеклянный лабораторный по ГОСТ 29224, шкального типа ТЛ-2 с пределом измерения от 0 °С до 100 °С и ценой деления 0,5 °С;

- прибор для встряхивания любого типа;

- микроизмельчитель тканей (гомогенизатор) любого типа с частотой вращения от 8000 до 24000 мин

;

- шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий поддержание температуры не менее (95±5) °С;

- термостат любого типа, поддерживающий температуру (37±1) °С;

- водяную баню любого типа, поддерживающую температуру (52±1) °С;

- микроцентрифугу любого типа с частотой вращения 7000 мин

;

- центрифугу с бакет-ротором и адаптером для флаконов типа фалькон объемом от 15 до 50 см

и частотой вращения от 3000 до 10000 мин

;

- ультразвуковую баню любого типа;

- роторный испаритель любого типа или устройство для испарения экстрактов, термостатируемый нагревательный модуль с системой отдувки растворителей инертным газом;

- мясорубку любого типа;

- электрическую мельницу любого типа;

- дозаторы механические с варьируемым объемом дозирования от 0,005 до 0,050; от 0,020 до 0,200; от 0,200 до 1,000 и от 1,000 до 5,000 см

в комплектах со съемными одноразовыми наконечниками;

- колбы 1-50 (100, 500)-2 по ГОСТ 1770;

- цилиндры 1(2,3)-10(100, 250)-1 по ГОСТ 1770;

- воронки ВФ-1(2)-60-ПОР 500 ТХС по ГОСТ 25336;

- стакан Н-2-100 ТХС по ГОСТ 25336;

- колбы типов Кн-1-50-24/29 ТС и Кн-2-50-18 ТС по ГОСТ 25336;

- коническую колбу со шлифом и притертой пробкой типа Кн-1-100-19/26 по ГОСТ 25336;

- пробирки типа П-1-10-0,1 ХС по ГОСТ 25336;

- пробирки типа эппендорф вместимостью 1,5 см

;

- стеклянные или полипропиленовые флаконы типа фалькон с завинчивающейся крышкой для отбора проб вместимостью от 15 до 50 см

7.2 Допускается использование другого оборудования и средств измерения с метрологическими и техническими характеристиками не ниже указанных.

7.3 При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

- тест-системы* для непрямого твердофазного конкурентного ИФА в комплектации в соответствии с приложением А, которые предназначены для определения синтетических анаболических стимуляторов роста в диапазонах измерений массовых концентраций, мкг/дм


кленбутерола	от 0,01 до 6,25;
метилтестостерона	от 0,1 до 62,5;
диэтилстильбестрола	от 0,0125 до 7,8125;
19-нортестостерона	от 0,0125 до 7,8125;
этинилэстрадиола	от 0,1 до 62,5;
тренболона	от 0,1 до 62,5;
дексаметазона	от 0,1 до 62,5;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

- спирт изопропиловый (изопропанол) по ГОСТ 9805, х.ч.;

- трис(гидроксиметил)аминометан с массовой долей основного вещества не менее 99%;

- этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) по ГОСТ 8981, х.ч.;

- кислоту хлорную массовой долей 57%, х.ч.;

- кислоту соляную по ГОСТ 3118, концентрированную, плотностью 1,19 г/см

, х.ч.;

- спирт бутиловый (бутанол) нормальный технический по ГОСТ 5208, х.ч.;

- трихлорметан по ГОСТ 20015, х.ч.;

- гексан с содержанием основного вещества не менее 98%, х.ч.;

- трет-бутил-метиловый эфир с массовой долей основного вещества не менее 98%, х.ч.;

- метанол-яд по ГОСТ 6995, х.ч.;

- метилен хлористый технический по ГОСТ 9968, х.ч.;

- ацетонитрил для хроматографии, ос.ч., с массовой долей основного вещества не менее 99,9%;

- кислоту ортофосфорную по ГОСТ 6552, концентрированную, х.ч.;

- дигидрофосфат натрия 2-водный, ч.д.а., по ГОСТ 245;

- гидрофосфат натрия безводный, х.ч., по ГОСТ 4172;

- глюкуронидазу/арилсульфатазу из Helix pomatia с содержанием основного вещества 132500 ед./г;

- натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, х.ч.;

- натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч., растворы молярной концентрацией 5 и 1 моль/дм

;

- натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.;

- кислоту уксусную с массовой долей 20% по ГОСТ 61;

- полиоксиэтиленсорбитан монолаурат (полисорбат 20, твин 20);

- кислоту серную по ГОСТ 4204, концентрированную;

- бихромат калия технический по ГОСТ 2652;

- бумагу масштабно-координатную по ГОСТ 334, марки Н-1.

_______________

* Так как тест-системы используют для количественного определения анаболиков и входящие в состав тест-систем исходные компоненты предназначены для воспроизведения, хранения и передачи характеристик состава или свойств веществ (материалов), т.е. соответствуют требованиям, предъявляемым к стандартным образцам, то в соответствии с ФЗ РФ "Об обеспечении единства измерений" в сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений следует применять стандартные образцы утвержденных типов, т.е. в установленном порядке тест-системы должны проходить процедуру утверждения типа стандартных образцов.

7.4 Допускается использование других реактивов и материалов, по качеству не ниже указанных.

8 Подготовка к выполнению измерений

8.1 Подготовка оборудования

8.1.1 При подготовке к проведению измерений лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

8.1.2 Подготовку и проверку фотометра и рН-метра проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации приборов.

8.2 Приготовление вспомогательных растворов для проведения подготовки проб

8.2.1 Для приготовления раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм

цилиндром вместимостью 10 см

отмеряют 8,5 см

концентрированной соляной кислоты (плотностью 1,19 г/см

), помещают в мерную колбу вместимостью 1 дм

, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре (23±5) °С в вытяжном шкафу - 1 мес.

8.2.2 Для приготовления раствора хлорной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм

цилиндром вместимостью 250 см

отмеряют 169,4 см

дистиллированной воды и переносят в коническую колбу вместимостью 200 см

. Затем цилиндром вместимостью 10 см

отмеряют 2,0 см

хлорной кислоты с массовой долей 57% и переносят в ту же колбу, смесь перемешивают и закрывают пришлифованной пробкой.

Срок хранения раствора при температуре (23±5) °С в вытяжном шкафу - 1 мес.

8.2.3 Для приготовления раствора фосфорной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм

в стакане взвешивают 9,8 г концентрированной ортофосфорной кислоты. С помощью стеклянной воронки кислоту переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

. Стакан несколько раз обмывают дистиллированной водой, смывы переносят в мерную колбу, после чего объем доводят дистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора при температуре (23±5) °С в вытяжном шкафу - 1 мес.

8.2.4 Для приготовления трис-буфера молярной концентрацией 0,1 моль/дм

с рН (9,5±0,2) навеску трис(гидроксиметил)аминометана массой 1,21 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

и добавляют 50 см

дистиллированной воды. Значение рН раствора доводят до (9,5±0,2), осторожно по каплям прибавляя и постоянно перемешивая раствор соляной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм

. Раствор в колбе доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.