ГОСТ 13496.21-87 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения лизина и триптофана.
ГОСТ 13496.21-87
Группа С19
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ
Методы определения лизина и триптофана
Feeds, mixed feeds and raw material. Methods for determining content of lisin and tryptophane
МКС 65.120
ОКСТУ 9209
Дата введения 1988-07-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Госагропромом СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 27.05.87 N 1715
3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер пункта, подпункта, перечисления, приложения |
| 3.2 |
| 2.2, 3.2 |
| 2.2, 3.2 |
| 2.2, 3.2, 4.2 |
| 3.2 |
| 2.2, 3.2, 4.2 |
| 3.2 |
| 2.2, 3.2, 4.2 |
| 4.2 |
| 3.2 |
| 2.2, 3.2 |
| 3.2 |
| 2.2, 3.2, 4.2 |
| 2.2, 3.2, 4.2 |
| 4.2 |
| 2.2, 3.2 |
| 1.1 |
| 1.1 |
| 1.1 |
| 2.2, 3.2 |
| 1.1 |
| 2.2, 3.2 |
| 2.2, 3.2 |
| 2.2, 3.2, 4.2 |
| 2.2, 3.2, 4.2 |
| 2.3.1 |
| 2.2, 3.2, 4.2 |
5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 2-92 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 2-93)
6. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Март 2011 г.
Настоящий стандарт распространяется на все виды кормов, комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает хроматографические и колориметрический методы определения в них аминокислот лизина и триптофана.
Стандарт предназначается для научно-исследовательских учреждений, лабораторий агрохимической службы, республиканских и зональных лабораторий комбикормовой промышленности.
1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ
1.1. Отбор проб - по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13979.0, ГОСТ 17681.
2. МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (НА АВТОАНАЛИЗАТОРЕ АМИНОКИСЛОТ)
2.1. Сущность метода заключается в расщеплении пептидных связей белка соляной кислотой или щелочью при нагревании и избирательной сорбции аминокислот на ионообменнике жидкостной хроматографической колонки. При реакции с нингидриновым реактивом образуется окрашенный комплекс, интенсивность которого пропорциональна содержанию аминокислоты в растворе.
2.2. Средства испытаний
Для проведения испытания применяют:
измельчитель проб растений ИПР-2;
сушилку проб кормов СК-1 или шкаф сушильный лабораторный, обеспечивающий погрешность поддержания температуры не более 5 °С;
мельницу лабораторную марки МРП-2;
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с пределом взвешивания 200 и 500 г по ГОСТ 24104*;
________________
* С 1 июля 2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 (здесь и далее).
автоклав по ГОСТ 14106;
шкаф сушильный типа СЭШ-ЗМ или аналогичный с рабочей температурой 110 °С, максимальным перепадом температур 2 °С и периодическим колебанием температур в рабочей зоне ±0,5 °С;
аминокислотный анализатор;
устройство для выпаривания гидролизатов УВГ-1;
холодильник бытовой;
рН-метр 340;
газовую горелку однопламенную универсальную по ГОСТ 1077;
баллон с газом пропан-бутан;
воронки стеклянные диаметром 4-6 см по ГОСТ 25336;
ступку фарфоровую;
фильтры беззольные с синей полосой диаметром 8 см по ГОСТ 12026;
набор реактивов к аминокислотному анализатору;
набор аминокислот стандартный;
спирт этиловый по ГОСТ 5962*;
________________
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000 (здесь и далее).
бария гидроокись, 8-водную по ГОСТ 4107, х. ч.;
натрий углекислый безводный по ГОСТ 83, х. ч., раствор с массовой долей 10%;
натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280, х. ч. или ч. д. а.;
фенол;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч., раствор с массовой долей 50%;
пропанол-2 (изопропиловый спирт);
воду дистиллированную по ГОСТ 6709.
Примечание. Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду или другие мерные средства измерений, имеющие аналогичные метрологические характеристики.
2.3. Подготовка к испытанию
2.3.1. Подготовка проб
Среднюю пробу сена, сенажа, соломы или зеленой массы, отобранную по ГОСТ 27262, измельчают на отрезки длиной до 1-3 см. Корнеплоды разрезают на пластинки (ломтики) толщиной до 0,8 см. Методом квартований выделяют часть средней пробы, масса которой после высушивания должна быть не менее 100 г. Высушивание проб проводят в сушильном шкафу при температуре 60-65 °С до воздушно-сухого состояния. После высушивания воздушно-сухую пробу размалывают на мельнице и просеивают через сито. Остаток на сите измельчают ножницами или в ступке, добавляют к просеянной части и тщательно перемешивают.
Средние пробы комбикормов, зерна, жмыхов, шротов, гранул, травяной муки или витаминной муки из древесной зелени размалывают без предварительного подсушивания и просеивают через сито.
Подготовленные пробы хранят в стеклянной или пластмассовой банке с крышкой в сухом темном месте.
2.3.2. Приготовление растворов и реактивов
2.3.2.1. Приготовление буферного раствора с рН 2,2
2.3.2.2. Приготовление нeйтpaлuзyющeгo раствора
2.3.2.3. Приготовление стандартного раствора лизина
2.3.2.4. Приготовление стандартного раствора триптофана
Рабочие стандартные растворы аминокислот готовят из основных разведением в буфере с рН 2,2 для лизина и водном растворе изопропанола - для триптофана.
2.4. Проведение испытания
2.4.1. Подготовка гидролизатов
а) Гидролиз в термостате
б) Гидролиз в автоклаве
2.4.1.2. Проведение гидролиза с гидроокисью бария для определения содержания триптофана
Перед нанесением на хроматографическую колонку рН гидролизатов доводят до 2,2. Для этого берут аликвотную часть гидролизата, подкисляют ее концентрированной соляной кислотой до рН 2,2 и приливают равный аликвотной части гидролизата объем буферного раствора с рН 2,2. При расчете учитывают данный фактор разведения.
2.4.2. Проведение анализа
Гидролизаты наносят на колонку автоанализатора аминокислот. Для сравнения испытуемых гидролизатов используют рабочий стандартный раствор аминокислоты. Анализ проводят по короткой программе с использованием буферного раствора для идентификации основных аминокислот в соответствии с правилами проведения анализа на аминоанализаторах.
В результате получают хроматограммы с пиками кривых, площади которых пропорциональны концентрациям аминокислот.
2.5. Обработка результатов
За результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.
Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.
Допускается проведение анализа без параллельных определений при наличии стандартных образцов для контроля правильности анализов и достаточной точности контрольных анализов при проведении внешнего и внутрилабораторного контроля.
В этом случае контроль сходимости параллельных определений проводят в соответствии с нормативно-техническими документами по внутрилабораторному контролю, утвержденными в установленном порядке.
3. МЕТОД ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ФИКСИРОВАННОМ СЛОЕ ИОНООБМЕННИКА
3.1. Сущность метода заключается в расщеплении пептидных связей белка соляной кислотой или щелочью при нагревании и избирательной сорбции аминокислот в тонком слое ионообменника. При реакции с нингидриновым реактивом образуется окрашенный комплекс, интенсивность которого пропорциональна содержанию аминокислоты в растворе.
3.2. Средства испытаний
Для проведения испытания применяют:
основной комплекс для тонкослойной хроматографии "АТХ" или ОЕ-304 фирмы "Лабор";
денситометр БНАН-170 или экстинкционно-регистрирующий прибор с интегратором ЕРУ-65-М фирмы "Карл Цейс Йена";
электрофен;
пульверизатор;
шкаф сушильный типа СЭШ-ЗМ или аналогичный с рабочей температурой 110 °С, максимальным перепадом температур 2 °С и периодическим колебанием температур в рабочей зоне ±0,5 °С;
термостат воздушный с регулируемой температурой в пределах 20-70 °С;
мельницу лабораторную марки МРП-2;
холодильник бытовой;
потенциометр рН-340;
измельчитель проб растений ИПР-2;
сушилку проб кормов СК-1 или шкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры не более 5 °С;
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с пределом взвешивания 200 и 500 г по ГОСТ 24104;
автоклав по ГОСТ 14106;
газовую горелку однопламенную универсальную по ГОСТ 1077;
воронки стеклянные диаметром 6 см по ГОСТ 25336;
фильтры беззольные с синей полосой диаметром 8 см по ГОСТ 12026;
бумагу фильтровальную;
набор аминокислот стандартный;
ацетон по ГОСТ 2603, ч. д. a.;
нингидрин кристаллический;
фенол, ч. д. а.;
натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280, х. ч. или ч. д. а.;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;
кадмий уксуснокислый двухводный по ГОСТ 5284;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч., раствор с массовой долей 50%;
бария гидроокись 8-водную по ГОСТ 4107;
натрий углекислый безводный по ГОСТ 83, х. ч., раствор с массовой долей 10%;
натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.;
кислоту лимонную по ГОСТ 3652, х. ч.;
кислоту ледяную уксусную по ГОСТ 61;
пропанол-2 (изопропиловый спирт);
метилцеллозольв (монометиловый эфир этиленгликоля);
воду дистиллированную по ГОСТ 6709.
Примечание. Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду или другие мерные средства измерений, имеющие аналогичные метрологические характеристики.
3.3. Подготовка к испытанию
3.3.1. Подготовка проб - по п.2.3.1.
3.3.2. Приготовление растворов и реактивов
3.3.2.1. Приготовление буферных растворов
Для приготовления буферных растворов используют дистиллированную воду и реактивы, указанные в табл.1. Корректируют рН буферных растворов концентрированной соляной кислотой или раствором гидроокиси натрия с массовой долей 50%.
Таблица 1
Реактивы | рН буферных растворов | |||
| 2,2 | 3,28 | 3,3 | 6,0 |
Лимонная кислота, г | - | 1,4 | 84,0 | 7,0 |
Натрий лимоннокислый, г | 19,6 | - | - | - |
Натрия гидроокись, г | - | 0,8 | 16,0 | 4,0 |
Хлористый натрий, г | - | - | - | 81,9 |
Соляная кислота, см | 16,6 | 1,2 | 5,9 | - |
Метилцеллозольв, см | - | - | - | 100,0 |
Фенол, см | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
3.3.2.2. Приготовление кадмиево-нингидринового реактива
3.3.2.3. Приготовление стандартных растворов аминокислот
Основные стандартные растворы лизина готовят по п.2.3.2.3 и триптофана - по п.2.3.2.4.
Рабочие стандартные растворы с близкими к предполагаемым концентрациям аминокислот в исследуемых пробах готовят из основных растворов разведением в буфере с рН 2,2 - для лизина и водном растворе изопропанола - для триптофана.
3.4. Проведение испытания
3.4.1. Подготовка гидролизатов
а) Гидролиз в термостате
При наличии стеклянных микропипеток гидролизат используют для нанесения на хроматографическую пластинку.
б) Гидролиз в автоклаве
При наличии стеклянных микропипеток гидролизат используют для нанесения на хроматографическую пластинку.
3.4.1.2. Проведение гидролиза с гидроокисью бария для определения содержания триптофана - по п.2.4.1.2 и операцию гидролиза заканчивают на стадии добавления равного объема раствора углекислого натрия.
3.4.2. Подготовка к хроматографированию
Стопку пластинок (3-5 шт.) помещают в камеру для хроматографирования, куда предварительно наливают буферный раствор с рН 3,28 слоем 1-1,5 см. Нижний край пластинок должен быть погружен в раствор на 1 см. Пластинки выдерживают в закрытой камере в течение суток при комнатной температуре, затем снимают фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Пластинки хранят в темном месте не более 1 мес.
3.4.2.2. Подготовка пластинок к хроматографированию
С краев уравновешенных пластинок счищают ионообменный слой смолы шириной 3 мм для более равномерного продвижения буферного раствора. На расстоянии 2 см от нижнего края пластинки простым карандашом проводят две линии с расстоянием между ними не более 1 мм (линия старта). На линии старта размечают 12 полосок длиной 1 см с расстоянием между ними 0,5 см. Каждую полоску ограничивают вертикальными бороздками (бороздки проводят острым предметом) для предотвращения расплывания пятен в ширину при хроматографировании.
3.4.2.3. Подготовка камеры для хроматографии
Для определения лизина камеру предварительно насыщают буферным раствором с рН 3,3, для триптофана - с рН 6,0. Стенки камеры выстилают одним слоем фильтровальной бумаги и на дно наливают растворитель слоем 1,5 см. Герметично закрытую камеру помещают в термостат с температурой хроматографирования соответствующей аминокислоты на 15-20 мин до полного пропитывания бумаги.
3.4.2.4. Подготовка микрошприца
Из микрошприца удаляют шток, а на верхний конец стеклянного цилиндра надевают резиновую трубку длиной 30 мм. Конец иглы микрошприца обрезают перпендикулярно ее длине на уровне половины скоса и срез зашлифовывают во избежание повреждения слоя смолы при нанесении растворов.
3.4.2.5. Нанесение растворов на пластинки
3.4.3. Хроматографирование
3.4.3.1. Условия хроматографирования для лизина
3.4.3.2. Условия хроматографирования для триптофана
Пластинку с нанесенным гидролизатом накладывают обратной стороной на стекло такого же размера и помещают в предварительно нагретую до температуры 30 °С камеру так, чтобы нижний край был погружен в буферный раствор с рН 6,0 на 1 см. Камеру герметично закрывают и помещают в термостат. Хроматографирование проводят при температуре 30 °С в течение 3 ч.
3.4.4. Проявление хроматограммы
По окончании хроматографирования пластинки вынимают из камеры и высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Кадмиево-нингидриновый реактив (смесь растворов А и В) распыляют пульверизатором по всей поверхности пластинки до полного смачивания. Реактив наносят равномерно, не допуская подтеков. После опрыскивания пластинку высушивают на воздухе в вытяжном шкафу и помещают на ночь в термостат при температуре 30 °С для полного развития окраски зон аминокислот.
3.4.5. Денситометрирование
Пластинку разрезают на отдельные хроматограммы и денситометрируют при длине волны 530 нм. В результате получают денситограмму с пиками кривых, площади которых пропорциональны концентрациям аминокислот.
Площадь пика определяют по п.2.4.2.
Массовую концентрацию аминокислоты в гидролизате пробы определяют по градуировочному графику.
Градуировочный график строят для каждой хроматографической пластинки. На оси абсцисс откладывают концентрации трех стандартных рабочих растворов, а по оси ординат соответствующие им площади пиков.
3.5. Обработка результатов
Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.
За результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.
4. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ТРИПТОФАНА С ПАРАДИМЕТИЛАМИНОБЕНЗАЛЬДЕГИДОМ (ДМАБ)
4.1. Сущность метода заключается в расщеплении пептидных связей белка в щелочном растворе гидроокиси бария при нагревании и последующем окрашивании освобожденного индольного кольца триптофана парадиметиламинобензальдегидом. В сильно кислой среде в присутствии нитрита натрия образуется голубая окраска, интенсивность которой измеряется на фотоэлектроколориметре.
4.2. Средства испытаний
Для проведения испытания применяют:
шкаф сушильный типа СЭШ-ЗМ с рабочей температурой (110±2) °С;
термостат воздушный с регулируемой температурой в пределах 20-70 °С;
сушилку проб кормов СК-1 или шкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры не более 5 °С;
мельницу лабораторную МРП-2;
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с пределом взвешивания 200 и 500 г по ГОСТ 24104;
холодильник бытовой;
фотоэлектроколориметр с длиной волны 650 нм (красный светофильтр), кюветой 5 мм;
насос водоструйный;
пенициллиновые флаконы;
колбу Бунзена по ГОСТ 25336;
воронку Бюхнера диаметром 8-10 см по ГОСТ 9147;
бумагу фильтровальную;
казеин по Гаммерстену;
триптофан;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;
бария гидроокись по ГОСТ 4107;
кислоту соляную концентрированную по ГОСТ 3118, х. ч.;
нитрит натрия раствор с массовой долей 0,2% по ГОСТ 4197, х. ч.;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709.
Примечание. Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду или другие мерные средства измерений, имеющие аналогичные метрологические характеристики.
4.3. Подготовка к испытанию
4.3.1. Подготовка проб - по п.2.3.1.
4.3.2. Приготовление растворов и реактивов
4.3.2.1. Приготовление раствора нитрита натрия
4.3.2.2. Приготовление раствора ДМАБ
4.3.2.3. Приготовление основного стандартного раствора триптофана
4.3.2.4. Приготовление рабочих стандартных растворов сравнения
Таблица 2
Наименование показателя
| Номер колбы со стандартными растворами сравнения
| ||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
Объем основного стандартного раствора триптофана, см | 0 | 1,0 | 1,5 | 2,0 | 2,5 | 3,0 | 3,5 | 4,0 | 4,5 |
Массовая концентрация триптофана в растворе сравнения в пересчете на массовую долю аминокислоты в анализируемой пробе, грамм на 1 кг воздушно-сухого корма | 0 | 1,0 | 1,5 | 2,0 | 2,5 | 3,0 | 3,5 | 4,0 | 4,5 |
4.3.2.5. Построение градуировочного графика
Строят градуировочный график, откладывая на оси абсцисс количество триптофана в граммах на 1 кг пробы, а на оси ординат - соответствующую величину оптической плотности.
Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности результатов двух отсчетов на приборе.
При стабильной работе прибора график проверяют по трем растворам сравнения в том интервале, в котором проводятся испытания. При нестабильной работе прибора растворы сравнения фотометрируют одновременно с испытуемыми растворами, каждый раз строя градуировочный график.
4.4. Проведение испытания
Для разведения гидролизатов проб с высоким содержанием триптофана используют первый раствор сравнения, приготовленный по п.4.3.2.4.
где 17,0 - теоретическая масса триптофана в казеине по Гаммерстену, грамм на 1 кг абсолютно сухого вещества;
4 - коэффициент пересчета.
4.5. Обработка результатов
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.
Допускается проведение анализа без параллельных определений при наличии стандартных образцов для контроля правильности анализов и достаточной точности контрольных анализов при проведении внешнего и внутрилабораторного контроля. В этом случае контроль сходимости параллельных определений проводят в соответствии с нормативно-техническими документами по внутрилабораторному контролю, утвержденными в установленном порядке.