ГОСТ 28001-88 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения микотоксинов: Т-2 токсина, зеараленона (Ф-2) и охратоксина А.

ГОСТ 28001-88

Группа С19

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

 ЗЕРНО ФУРАЖНОЕ, ПРОДУКТЫ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ, КОМБИКОРМА

 Методы определения микотоксинов:

Т-2 токсина, зеараленона (Ф-2) и охратоксина А

 Fodder grain, products of its processing, mixed feeds.

Methods for determination of micotoxins:

T-2 toxin, zearalenon (F-2) and ochratoxin A

 ОКСТУ 9209

Дата введения 1990-01-01

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Госагропромом СССР

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 23.12.88 N 4567

3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол 4-94)

6. ПЕРЕИЗДАНИЕ

Настоящий стандарт распространяется на фуражное зерно, продукты его переработки и все виды комбикормов и устанавливает методы определения токсинов Т-2, зеараленона (Ф-2) и охратоксина А.

Стандарт применяют в ветеринарных лабораториях Госагропрома СССР.

 1. ОТБОР ПРОБ

Отбор проб - по ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13496.0, ГОСТ 20239, ГОСТ 12430.

 2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т-2 ТОКСИНА В ФУРАЖНОМ ЗЕРНЕ

Сущность метода заключается в извлечении токсина ацетоном, очистке экстракта от липидов и растительных пигментов с последующей доочисткой на хроматографической колонке и двукратном хроматографировании его на пластинке "Силуфол" со стандартным раствором токсина. Чувствительность метода - 600 мкг/кг кормового средства.

2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Шуттель-аппарат.

Баня водяная, электрическая (2-4-гнездная).

Весы аналитические марки АДВ-200.

Весы лабораторные 2-го класса точности по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

___________________

* С 1 июля 2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001 (здесь и далее).

Мельница лабораторная электрическая.

Источник ультрафиолетовых лучей с длиной волны 365 нм марки ОИ-18, ВИО-1 или других аналогичных марок.

Микрошприц вместимостью 0,01 см

.

Шкаф сушильный.

Набор сит.

Испаритель роторный.

Распылитель стеклянный (пульверизатор).

Холодильник.

Электрофен бытовой по ГОСТ 22314.

Мельница шаровая.

Эксикатор диаметром 29 см.

Штатив Бунзена.

Штатив для пробирок.

Пробирки стеклянные мерные с притертой пробкой вместимостью 5 и 10 см

по ГОСТ 1770.

Пробирки центрифужные вместимостью 10 см

.

Воронки стеклянные диаметром 4, 6, 8 см по ГОСТ 25336.

Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 500 и 250 см

.

Колбы мерные исполнений 1 и 2 вместимостью 25, 50, 100 см

2-го класса точности по ГОСТ 1770.

Воронки делительные типа ВД, исполнений 1-3, вместимостью 500 см

по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5 вместимостью 1, 2 и 10 см

2-го класса точности по нормативно-технической документации.

Цилиндры мерные вместимостью 25, 50 и 100 см

по ГОСТ 1770.

Чашки фарфоровые диаметром 15 см по ГОСТ 9147.

Колонка хроматографическая диаметром 1,8 см, высотой 18-20 см.

Пластинки хроматографические "Силуфол" с флюоресцентным слоем марки ИУ-254, размером 15х15 см.

Камера хроматографическая.

Бумага лабораторная фильтровальная по ГОСТ 7584.

Алюминия окись для хроматографии, 2-й степени активности по Брокману, ч.

Ацетон по ГОСТ 2603, ч. д. а.

Гексан, х. ч.

Кальция окись по ГОСТ 8677, х. ч.

Кальций хлористый плавленый, ч.

Кислота азотная по ГОСТ 4461, х. ч.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, х. ч.

Кислота уксусная, ледяная по ГОСТ 61, х. ч.

Кислота серная по ГОСТ 4204, х. ч.

Серебро азотно-кислое по ГОСТ 1277, ч. д. а.

Силикагель марки КСК.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*.

_________________

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000 (здесь и далее).

Толуол по ГОСТ 5789, ч. д. а.

Хлороформ для наркоза по ГОСТ 20015.

Этилацетат по ГОСТ 22300, ч.

Стандарт микотоксина Т-2.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечание. Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду или другие мерные средства измерений, имеющие аналогичные метрологические характеристики.

2.2. Подготовка к испытанию

2.2.1. Подготовка проб к испытанию

Из средней пробы фуражного зерна методом квартования выделяют часть пробы массой не менее 100 г, которую размалывают на электромельнице до такого состояния, чтобы она проходила без остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Подготовленную для испытания пробу хранят в стеклянной колбе с крышкой в сухом темном месте.

2.2.2. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку заполняют в следующей последовательности: вначале помещают тампон гигроскопической ваты, затем 1 г силикагеля, 2 г окиси алюминия и 2 г окиси кальция. Силикагель и окись алюминия вносят небольшими порциями, слегка постукивая по колонке. Для удаления пузырьков воздуха промывают колонку небольшим количеством хлороформа (15-20 см) при отсасывании водоструйным насосом. Окись кальция вносят в колонку в виде хлороформной суспензии при отсасывании водоструйным насосом.

2.2.3. Приготовление растворов и реактивов

2.2.3.1. Приготовление 20%-ного спиртового раствора серной кислоты

11,5 см

серной кислоты небольшими порциями, при осторожном перемешивании, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

с небольшим количеством этилового спирта (15-20 см). После охлаждения раствора постепенно, при постоянном перемешивании, добавляют в колбу этиловый спирт до метки. Охлаждают при комнатной температуре и окончательно доводят раствор в колбе спиртом до метки.

2.2.3.2. Приготовление системы растворителей

Растворитель 1. Гексан смешивают с этилацетатом в соотношении 1:1. Высота слоя налитой в хроматографическую камеру жидкости не должна превышать 0,5 см;

Растворитель 2. Толуол смешивают с этилацетатом и муравьиной кислотой в соотношении 6:3:1 или хлороформ смешивают с этилацетатом и уксусной ледяной кислотой в соотношении 17:3:1.

2.2.3.3. Приготовление водного раствора азотно-кислого серебра с массовой долей 2%

1 г азотно-кислого серебра помещают в мерную колбу вместимостью 50 см

, добавляют дистиллированную воду до метки. Раствор хранят в холодильнике.

2.2.3.4. Приготовление силикагеля

Силикагель размалывают на шаровой мельнице и заливают на 18-20 ч соляной кислотой, разбавленной водой 1:1. Затем кислоту сливают и силикагель промывают водой до отсутствия в промывных водах следов иона хлора. Для этого к 1 см

промывных вод прибавляют 1 см

раствора азотно-кислого серебра с массовой долей 2% и 1 см

азотной кислоты. В присутствии иона хлора выпадает осадок белого цвета. Затем силикагель промывают ацетоном, просушивают под тягой до исчезновения запаха ацетона и высушивают в сушильном шкафу при температуре 130 °С в течение 4-6 ч. Очищенный и высушенный силикагель просеивают через сито. Для заполнения хроматографической колонки используют фракцию, проходящую через сито с размером отверстий 0,105 мм и задерживающуюся на сите - 0,075 мм. Силикагель хранят в плотно закрытых сосудах.

2.2.3.5. Подготовка окиси кальция, силикагеля и пластинки "Силуфол"

Окись кальция, силикагель и пластинки "Силуфол" перед использованием активируют нагреванием в сушильном шкафу при температуре 100 °С в течение 1 ч. Окись кальция предварительно растирают в фарфоровой ступке.

2.2.3.6. Приготовление стандартного раствора микотоксина Т-2

Взвешивают в стаканчике вместимостью 25 см

0,0250 г (точная навеска) кристаллического микотоксина Т-2, переносят с помощью этилового спирта или ацетона в мерную колбу вместимостью 50 см

и доводят объем раствора спиртом или ацетоном до метки. В 1 см

раствора содержится 0,5 мг Т-2 токсина. Раствор устойчив в течение 3 мес при хранении на холоде.

2.3. Проведение испытания

2.3.1. Из подготовленной для испытания пробы зерна отбирают навеску массой 25 г и помещают в колбу вместимостью 500 см

. В колбу вносят 150 см

ацетона и встряхивают на шуттель-аппарате 1,5 ч (либо оставляют на 18-20 ч при комнатной температуре). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу, а остаток корма еще раз заливают 100 см

ацетона, вновь встряхивают 30 мин и фильтруют через тот же фильтр в соответствующую колбу. Фильтр промывают 10 см

ацетона, присоединяя фильтрат к общему ацетоновому экстракту, который переносят в делительную воронку. К ацетоновому экстракту добавляют 25 см

гексана, перемешивают и добавляют 50 см

воды. После разделения слоев гексановую фракцию (верхний слой) удаляют, а нижний слой (водно-ацетоновая фракция) повторно экстрагируют 25 см

гексана при перемешивании растворов. Выделившийся после отстаивания смеси верхний гексановый слой снова удаляют

.

2.3.2. Водно-ацетоновую фракцию экстрагируют 25 см

хлороформа. Содержимое перемешивают 2 мин и оставляют для разделения слоев. После разделения слоев хлороформную фракцию (нижний слой) собирают в отдельную колбу, а затем пропускают через подготовленную хроматографическую колонку. Очищенный на колонке от примесей экстракт собирают в колбу для отгона или выпарительную чашку. Экстракцию водно-ацетоновой фракции хлороформом проводят еще два раза, экстрагируя каждый раз 20 см

хлороформа и пропуская каждую порцию экстракта через хроматографическую колонку. Экстракты, очищенные на колонке, собирают вместе в колбе для отгона или выпарительной чашке. Затем колонку три раза промывают хлороформом по 30 см

с последующим присоединением промывных порций к основному экстракту, находящемуся в колбе для отгона.

2.3.3. Колбу для отгона соединяют с перегонным аппаратом или роторным испарителем и содержимое ее концентрируют на кипящей водяной бане до 3 см

. При использовании выпарительной чашки раствор упаривают также на кипящей водяной бане до 2-3 см

. Концентрированный хлороформный экстракт переносят в центрифужную пробирку. Колбу трехкратно ополаскивают 1-1,5 см

хлороформа, присоединяя эти порции к основному раствору в пробирке. Пробирку нагревают на водяной бане до полного удаления хлороформа. Нагревание ведут вначале при температуре 80-85 °С, а затем по мере уменьшения объема раствора температуру снижают до 60 °С.

2.3.4. Остаток в пробирке растворяют в 0,1 см

ацетона и наносят микрошприцем на стартовую линию хроматографической пластинки "Силуфол". Пробы наносят по 0,01 см

на расстоянии 1,5 см друг от друга и нижнего края пластинки. Одновременно с исследуемыми растворами на пластинку наносят 0,002 см

стандартного спиртового или ацетонового раствора токсина Т-2. Пластинку с нанесенными пробами помещают в насыщенную парами растворителей хроматографическую камеру таким образом, чтобы стартовая линия располагалась на 0,5 см выше уровня подвижного растворителя. Первое хроматографирование проводят в системе этилацетат - гексан (1:1). Когда фронт растворителя продвинется на высоту 14,5 см от нижнего края пластинки, хроматограмму извлекают из камеры, 5-7 мин подсушивают на воздухе, а затем 1-2 мин в сушильном шкафу при температуре 100 °С. После высушивания хроматограмму повторно помещают в камеру с системой растворителей хлороформ - этилацетат - уксусная кислота (17:3:1) или толуол - этилацетат - муравьиная кислота (6:3:1). Когда фронт смеси растворителей продвинется на высоту 14,5 см, хроматограмму извлекают из камеры, подсушивают на воздухе, обрабатывают 20%-ным спиртовым раствором серной кислоты из пульверизатора и помещают в сушильный шкаф с температурой 110 °С. Пластинку выдерживают в сушильном шкафу 3-5 мин до небольшого потемнения. После этого пластинку извлекают из шкафа, охлаждают и просматривают в ультрафиолетовых лучах длиной 365 нм.