ГОСТ 21237-75
Группа Н19
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МЯСО
Методы бактериологического анализа
Meat. Methods of bacteriological analysis
ОКСТУ 9209
Дата введения 1977-01-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Государственным агропромышленным комитетом СССР
РАЗРАБОТЧИКИ
В.М.Горбатов, В.Г.Дедаш, Е.М.Фрейдлин
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 14.11.75 N 3054
3. ВЗАМЕН ГОСТ 7269-54 в части раздела II
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)
6. ПЕРЕИЗДАНИЕ (март 1999 г.) с Изменениями N 1, 2, утвержденными в октябре 1981 г., январе 1987 г. (ИУС 1-82, 4-87)
Настоящий стандарт распространяется на мясо и субпродукты от всех видов убойного скота и устанавливает методы бактериологического исследования для выявления в них аэробных бактерий (бацилл сибирской язвы, бактерий из рода сальмонелл, бактерий из рода кишечной палочки-Эшерихий, бактерий из рода протея, бактерий рожи свиней, бактерий листериоза, бактерий пастереллеза, бактерий из группы кокков) и анаэробных бактерий (патогенных и токсигенных клостридий).
Бактериологическое исследование мяса и субпродуктов производят во всех случаях, предусмотренных действующей нормативно-технической документацией, правилами ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов и другими нормативными актами, а также по требованию органов, осуществляющих ветеринарный или санитарный надзор.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ
1.1. В зависимости от характера заболевания на бактериологическое исследование направляют от туши:
- часть мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней конечностей туши длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8x6x6 см;
- лимфатические узлы - поверхностный шейный или собственно подкрыльцовый и наружный подвздошный вместе с окружающей их соединительной и жировой тканью, а от свиней - поверхностный шейный дорзальный (при отсутствии патологических изменений в области головы и шеи) или подкрыльцовый первого ребра и надколенный;
- долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи, почку и селезенку.
Для бактериологического исследования на листериоз направляют: головной мозг, долю печени и почку.
Для бактериологического исследования на возбудителя сибирской язвы направляют лимфатический узел пораженного органа или лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации подозрительного фокуса, отечную ткань, ухо, а у свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический узел.
При исследовании полутуш или четвертин туш берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.
При исследовании соленого мяса, находящегося в бочечной таре, берут образцы мяса и имеющиеся лимфатические узлы сверху, из середины и со дна бочки, а также, при наличии, трубчатую кость и рассол.
Примечание. Если берут часть печени, почки, селезенки, то поверхность разреза прижигают.
1.2. Образцы завертывают каждый в отдельности в полиэтиленовую пленку по ГОСТ 10354 или пергамент по ГОСТ 1341, помещают в бумажный пакет, на котором ставят дату отбора образца, номер туши и направляют в лабораторию в общей таре (ящике).
1.3. При необходимости пересылки образцов в лабораторию, расположенную за пределами предприятия или хозяйства, где отбирают образцы, тару с образцами опечатывают или пломбируют.
В сопроводительном документе указывают:
- наименование продукта с указанием вида мяса, от которого взят образец, и его количество;
- наименование предприятия или хозяйства, где отобран образец, и его адрес;
- номера образцов;
- причину направления образцов на исследование;
- краткие патологоанатомические данные и предполагаемый диагноз;
- дату взятия образцов и подпись лица, направившего их на исследование.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
2.1. Для проведения бактериологического исследования применяют:
автоклав;
аппарат Коха;
баню водяную с терморегулятором;
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104;
весы торзионные;
гомогенизатор бактериологический или аппарат для измельчения тканей с числом оборотов не менее 8000 об/мин и не более 45000 об/мин;
горелки газовые;
дистиллятор;
котлы с паровой рубашкой;
компаратор;
лупу с увеличением 3-5
микроскоп типа МБИ или МБР или других аналогичных марок;
мясорубку бытовую по ГОСТ 4025;
ножи;
ножницы медицинские по ГОСТ 21239;
осветитель ОИ-19;
пинцеты медицинские по ГОСТ 21241;
потенциометр или рН-метр;
спиртовки стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;
термостат электрический с автоматическим регулятором;
ультратермостат;
флаконы Сокслета (бутылки для детского питания);
холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317;
часы песочные по ОСТ 25-11-38 на 1, 2, 5 и 15 мин;
шкаф сушильный электрический лабораторный;
бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
бутылки стеклянные;
вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;
воду бромную;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
воду питьевую по ГОСТ 2874*;
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51232-98.
воронки стеклянные по ГОСТ 25336, конусообразные, вместимостью 250, 500 см 
;
дрожжи прессованные по ГОСТ 171;
желчь крупного рогатого скота свежую или сухую обезвоженную;
кастрюли;
колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;
кровь крупного рогатого скота, овец, лошадей;
марлю медицинскую по ГОСТ 9412;
масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164;
масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
мел химически осажденный по ГОСТ 6253;
мясо-говядину по ГОСТ 779;
панкреатин пищевой сухой;
пенициллин;
пептон венгерской фирмы "Рихтер";
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;
пептон чешской фирмы "Спофа";
петледержатели;
печень говяжью;
пипетки вместимостью 1, 2 см
с ценой деления 0,05 и 0,1 см
и вместимостью 10 см
;
плазму цитратную кроличью сухую;
железу поджелудочную крупного рогатого скота;
поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм, диаметром соответственно 2, 5 и 10 мм;
посуду мерную стеклянную по ГОСТ 1770;
набор агглютинирующих адсорбированных сальмонеллезных сывороток: поливалентной О-сыворотки групп А, В, С, D и Е и моновалентных О- и Н-сывороток;
пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336;
пробки корковые по ГОСТ 5541;
пробки резиновые;
проволоку из никелевых сплавов диаметром 0,3-0,5 мм по ГОСТ 1791;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
спирт денатурированный;
стекла покровные по ГОСТ 6672;
стекла предметные по ГОСТ 9284;
ступки фарфоровые с пестиками по ГОСТ 9147;
хлороформ технический по ГОСТ 20015;
цилиндры вместимостью 100, 250, 500 см
чашки с крышками стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 (чашки Петри);
штативы для пробирок;
шумовку;
эозин бактериологический;
яйца куриные;
бриллиантовый зеленый;
бромтимоловый синий;
генциан фиолетовый (генцианвиолет);
глицерин по ГОСТ 6259, х.ч.;
Д-глюкозу по ГОСТ 6038, Д (+), х.ч.;
желатин по ГОСТ 11293;
йод металлический по ГОСТ 4159, х.ч.;
калий йодистый по ГОСТ 4232, х.ч.;
калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493, х.ч.;
калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.;
кислоту карболовую кристаллическую;
кислоту фосфорную по ГОСТ 6552;
кристаллический фиолетовый (кристаллвиолет);
лактозу, х.ч.;
магний сернокислый по ГОСТ 4523, х.ч.;
магний хлористый по ГОСТ 4209, х.ч.;
маннит (маннитол) по ГОСТ 8321, х.ч., Д (-);
синь метиленовую;
метиловый красный по ГОСТ 5853;
метиловый фиолетовый медицинский (метилвиолет);
мочевину по ГОСТ 6691, х.ч.;
набор углеводов для исследования ферментации микробов кишечной группы (большой);
натрий-аммоний фосфорнокислый по ГОСТ 4170;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
натрий двууглекислый по ГОСТ 4201, х.ч.;
натрий кислый селенистокислый (без теллура);
натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280;
натрий сернистокислый (сульфит натрия) безводный по ГОСТ 195, х.ч.;
тиосульфат натрия по ГОСТ 27068, х.ч.;
натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный по ГОСТ 11773, х.ч.;
натрий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245, х.ч.;
натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.;
парадиметиламидобензальдегид;
сафранин;
сахарозу по ГОСТ 5833, х.ч.;
свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027;
соль закиси железа и аммония двойную сернокислую (соль Мора) по ГОСТ 4208;
фенол;
феноловый красный по ГОСТ 4599, х.ч.;
фуксин кислый для микробиологических целей;
фуксин основной для микробиологических целей;
агар микробиологический по ГОСТ 17206;
агар сухой питательный;
агар Плоскирева сухой бактериологический;
агар сухой висмут-сульфит;
агар сухой с эозин-метиленовым синим (среда Левина);
воду мясную по ГОСТ 20729;
бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
диализат или экстракт дрожжевой;
раствор Хенкса;
сальмонеллезный О-бактериофаг;
сибиреязвенный фаг "гамма МВА".
(Измененная редакция, Изм. N 1, 2).
3. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ
3.1. Приготовление питательных сред, реактивов, красок
3.1.1. Приготовление мясо-пептонного агара
К 1000 см
мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.
Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50-55 °С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см
мясо-пептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч, чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают в нем рН 7,0-7,4, разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120
3.1.2. Приготовление основного раствора Хоттингера
1000 г мяса, освобожденного от жира и сухожилий, нарезают кусками размером 1-2 см и опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством кипящей водопроводной воды. Кипятят в течение 15-20 мин, пока цвет мяса не станет серым; это указывает на то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и измельчают на мясорубке. Оставшуюся жидкость фильтруют и в ней устанавливают рН 8,0. Фарш опускают в отфильтрованную жидкость и охлаждают до температуры 40 °С в открытой кастрюле, затем добавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды измельченную поджелудочную железу в количестве 10% к полученной взвеси (на 1000 см
жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0,5-1,0% (в зависимости от его активности). Полученную смесь хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают 10%-ным раствором гидроокиси натрия до рН 7,8-8,0 и повторяют такое же подщелачивание через 30 мин. Отсутствие сдвига реакции смеси указывают на его доброкачественность.
После установления рН смесь переливают в бутыль с хорошо подобранной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы
часть бутыли оставалась свободной. Затем добавляют в количестве 1-3% от объема хлороформа (в холодное время года - меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают, после чего вынимают пробку для удаления избытка хлороформа и тут же снова закрывают.
Через 1-2 ч после добавления поджелудочной железы или панкреатина проверяют реакцию, устанавливают рН 7,4-7,6 и оставляют смесь для переваривания на 7-16 суток при комнатной температуре до образования аморфного осадка.
Первые 3-4 суток переваривания ежедневно проверяют реакцию среды и поддерживают рН на уровне 7,4-7,6. В течение этого времени встряхивают жидкость не менее трех раз в сутки так же, как указано выше. В дальнейшем встряхивать можно реже.
За 1-2 суток до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы гидролизат отстоялся. Конец переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки собирается аморфный осадок; жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет; гидролизат легко фильтруется; реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3-4 см
фильтрованного гидролизата, добавляют три-четыре капли бромной воды); при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет, в то время как контрольная пробирка с гидролизатом без бромной воды имеет желтое окрашивание. 5%-ный гидролизат должен содержать 1,1-1,2% общего азота. После гидролиза жидкость фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, сливают в бутыль и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120
Приготовленную среду можно хранить пять месяцев. Перед употреблением жидкость фильтруют.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
3.1.3. Приготовление бульона Хоттингера
К 100 см
основного раствора добавляют 500 см
водопроводной воды, 3 г хлористого натрия и 0,12 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Полученный раствор кипятят в течение 10 мин, фильтруют, устанавливают рН 7,2-7,4 и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120
3.1.4. Приготовление физиологического раствора
В 1000 см
дистиллированной воды растворяют 8,5 г химически чистого хлористого натрия. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120
3.1.5. Приготовление среды Левина
К 100 см
расплавленного мясо-пептонного агара с рН 7,0-7,4, приготовленного по п.3.1.1, добавляют 2 см
0,5%-ного водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 см
2%-ного раствора эозина (бактериологического), 2 г лактозы и 0,2 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют 1 ч при температуре 100 °С. После добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают, разливают в чашки и подсушивают. Среда должна иметь красно-фиолетовый цвет.
Среда Левина может быть приготовлена из сухой стандартной среды по прописи, указанной на этикетке.
3.1.6. Среды фуксин-сульфитный агар (среда Эндо), бактоагар Плоскирева, висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера) могут быть приготовлены из сухих стандартных сред по прописи, указанной на этикетке.
3.1.7. Приготовление среды Мюллера
Для приготовления среды Мюллера вначале готовят растворы серноватистокислого натрия и Люголя.
В мерный цилиндр с 50 г серноватистокислого натрия добавляют до 100 см
дистиллированной воды. Раствор переливают в бутыль и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.
Для приготовления раствора Люголя в 100 см
дистиллированной воды растворяют 25 г металлического йода, 20 г йодистого калия.
Для приготовления среды Мюллера в стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела и стерилизуют их сухим паром в течение 1 ч. Затем наливают в каждый флакон по 90 см
бульона из перевара Хотгингера, содержащего 0,13-0,15% аминного азота, устанавливают рН 7,2-7,4 и стерилизуют 30 мин при температуре 120 °С. После стерилизации вновь устанавливают рН 7,2-7,4, для чего проверяют в одном из флаконов и определяют необходимый для подтитровки данного количества среды объем соляной кислоты или гидроокиси натрия. Затем в асептических условиях перед употреблением добавляют по 2 см
раствора Люголя и по 10 см
раствора серноватистокислого натрия.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
3.1.8. Приготовление среды Кауфмана
К 500 см
стерильной среды Мюллера, приготовленной по п.3.1.7, добавляют 25 см
стерильной желчи крупного рогатого скота и 5 см
0,1%-ного водного раствора бриллиантовой зелени. Смесь хорошо взбалтывают, разливают в стерильные флаконы, но не стерилизуют.
3.1.9. Приготовление селенитового Ф-бульона
Среду готовят из двух основных растворов - А и Б.
Раствор А состоит из 5 г пептона чешской фирмы "Спофа" или венгерской фирмы "Рихтер", 7 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия, 3 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, 4 г х.ч. лактозы, 100 см
дистиллированной воды, рН раствора 6,9-7,1. Раствор стерилизуют 30 мин при температуре 112
Раствор Б состоит из 10%-ного раствора кислого селенистокислого натрия, приготовленного на стерильной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
При изменении серии любого из входящих в среду компонентов (пептона, кислого селенистокислого натрия, фосфатов) проводят предварительно подтитровку, для чего экспериментально определяют точную пропорцию фосфорнокислого двузамещенного безводного натрия и фосфорнокислого однозамещенного натрия, которая с используемыми образцами пептона и селенистокислого натрия дает рН не выше 6,9-7,1, что регулируется изменением соотношения фосфатов.
Для приготовления селенитовой среды к 50 см
раствора А стерильно добавляют 2 см
раствора Б. Среду разливают в стерильные флаконы или колбы, но не стерилизуют.
3.1.10. Приготовление хлористомагниевой среды "М" (модифицированной)
Среду готовят из трех основных растворов А, Б и В.
Для приготовления раствора А в 90 см
дистиллированной воды растворяют 0,42 г сухого ферментативного пептона, 0,7 г хлористого натрия, 0,15 г однозамещенного фосфорнокислого калия, 4 см
дрожжевого диализата.
Для приготовления раствора Б в 9 см
дистиллированной воды растворяют 3,6 г кристаллического хлористого магния.
Раствор В состоит из 0,09 см
5%-ного водного раствора бриллиантовой зелени.
Для приготовления хлористомагниевой среды "М" (модифицированной) растворы А, Б и В смешивают и стерилизуют 30 мин при температуре 112,5 °С.
Концентрированную среду готовят, удваивая содержание всех компонентов, кроме дистиллированной воды.
При отсутствии дрожжевого диализата допускается применять дрожжевой экстракт.
3.1.11. Приготовление дрожжевого экстракта
В 2000 см
дистиллированной воды растворяют 1000 г прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4
Жидкость над осадком декантируют, приливают 2,5 см
0,01%-ного раствора кристаллического фиолетового, разливают во флаконы или пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100 °С в течение 30 мин. Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4-6
3.1.12. Приготовление среды Киллиана
К 100 см
стерильного питательного бульона (рН 6,8-6,9) стерильно добавляют 1 см
0,1%-ного раствора бриллиантовой зелени. Раствор бриллиантовой зелени готовят следующим образом: 0,1 г бриллиантовой зелени заливают 100 см
дистиллированной воды, помещают во флаконы с резиновой или корковой пробкой и помещают в термостат при температуре 37
3.1.13. Приготовление трехсахарного агара с мочевиной (Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука)
В 1000 см
дистиллированной воды растворяют 2 г глюкозы, 3,5 г сахарозы, 15 г лактозы, 0,6 г соли Мора, 1 г серноватистокислого натрия и 10 г мочевины. Соль Мора и серноватистокислый натрий предварительно растворяют в 5-7 см
дистиллированной воды в пробирках. Углеводы и мочевину также растворяют в 10 см
дистиллированной воды в колбе на водяной бане. До стерилизации устанавливают рН 7,4-7,6 и добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором "ВР". Раствор размешивают и кипятят до расплавления агара, разливают в пробирки по 5-6 см
в каждую. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин или при температуре 112 °С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см).
3.1.14. Приготовление пептонно-углеводных сред (среды Гисса)
К 100 см
дистиллированной воды прибавляют 1 г сухого ферментативного пептона, 0,5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор, пока раствор не станет совершенно прозрачным. Устанавливают рН 0,7, прибавляют 0,5 г углевода и 1 см
индикатора Андреде.
Среду разливают по 5 см
в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре 110 °С. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка. Можно использовать готовые среды Гисса.
Для приготовления индикатора Андреде к 100 см
дистиллированной воды добавляют 16,4 см
1 моль/дм
раствора гидроокиси натрия и 0,5 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при температуре 110-112 °С. Индикатор хранят в склянке из темного стекла.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
3.1.15. Приготовление пептонной воды
К 1000 см
дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, фильтруют и устанавливают рН 7,2-7,4, после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120
3.1.16. Приготовление плазмы крови
В пробирку вносят 2 см
5%-ного раствора лимоннокислого натрия и 8 см
только что полученной крови кролика. Цитратную кровь ставят на 18-20 ч в холодильник при температуре 4-6 °С или подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 15 мин. В результате чего над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета - плазмы, которую разводят физиологическим раствором 1:4.
3.1.17. Приготовление дефибринированной крови
В колбу со стеклянными бусами сливают 8 см
только что взятой крови кролика, барана, лошади и непрерывно встряхивают в течение 10-15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивает бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринированная кровь утрачивает способность свертываться.
3.1.18. Приготовление кровяного агара
К 100 см
расплавленного стерильного мясо-пептонного агара, приготовленного по п.3.1.1 и охлажденного до температуры 45 °С, стерильно прибавляют 5-10 см
стерильно взятой дефибринированной крови. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, дают ей застыть и подсушивают в термостате при температуре 37 °С. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.
3.1.19. Приготовление агара Симмонса
В 1000 см
дистиллированной воды растворяют 5 г хлористого натрия, 0,2 г сернокислого магния, 1,5 г фосфорнокислого натрия-аммония, 2 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 5 г нейтрального лимоннокислого натрия, 20 г агара. Раствор фильтруют, добавляют 40 см
раствора бромтимолового синего (1:500). Среду разливают в пробирки по 5-6 см
в каждую, стерилизуют при температуре 120 °С в течение 20 мин, после чего скашивают. Готовая среда должна быть оливкового цвета.
3.1.20. Приготовление среды Государственного контрольного института (ГКИ)
В стерильную колбу наливают 60 см
раствора Хенкса и добавляют стерильно 40 см
сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при температуре 56 °С в течение 30 мин. После тщательного перемешивания устанавливают рН 7,2 раствором двууглекислого натрия и разливают среду по 2 см
в стерильные пробирки, которые закрывают стерильными резиновыми пробками. Среду можно хранить при температуре 4
3.1.21. Приготовление среды Дрожжевкиной
К 10 см
стерильного желтка куриного яйца добавляют 90 см
физиологического раствора, тщательно перемешивают. Смесь разливают по 8 см
в стерильные пробирки. Перед употреблением проверяют стерильность среды, поместив ее в термостат при температуре 37
3.1.22. Приготовление среды Китт-Тароцци
Свежую печень крупного рогатого скота разрезают на куски массой по 50-60 г, заливают равным количеством воды и кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании. Печеночный экстракт фильтруют через ватно-марлевый фильтр и смешивают с мясо-пептонным бульоном из расчета одна часть печеночного экстракта на три части бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют хлористый натрий из расчета 1,25 г на 1000 см
среды и устанавливают рН 7,6-7,8, после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный фильтр.
В пробирки кладут мелко нарезанные кусочки печени по 1,5-2 г и заливают смесью печеночного экстракта с мясо-пептонным бульоном. На поверхность среды наслаивают 0,5-1 см
вазелинового масла. Среду стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120
3.1.23. Разведение пенициллина
На каждые 100 тыс. ед. пенициллина добавляют 1 см
стерильной дистиллированной воды и получают основное разведение, содержащее 100 тыс. ед. пенициллина в 1 см
. Например, во флакон, содержащий 500 тыс. ед. пенициллина, нужно внести 5 см
дистиллированной воды.
В пять пробирок наливают по 4,5 см
в каждую стерильной дистиллированной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 см
пенициллина основного разведения и получают в первой пробирке разведение, содержащее 10 тыс. ед. пенициллина в 1 см
раствора. Новой пипеткой из первой пробирки, тщательно перемешав содержимое, переносят 0,5 см
раствора во вторую пробирку и получают разведение, содержащее 1000 ед. пенициллина в 1 см
раствора. Таким же образом из второй пробирки переносят в третью 0,5 см
и получают разведение, содержащее 100 ед. пенициллина в 1 см
раствора. Из третьей пробирки переносят 0,5 см
в четвертую и получают разведение, содержащее 10 ед. в 1 см
раствора. Из четвертой пробирки переносят 0,5 см
в пятую и получают в пятой пробирке разведение, содержащее 1 ед. пенициллина в 1 см
р
аствора.
3.1.24. Приготовление мясо-пептонного агара с пенициллином
В три колбочки или большие пробирки, содержащие по 20 см
стерильного расплавленного и охлажденного до температуры 45-50 °С мясо-пептонного агара (рН 7,2), добавляют в первую колбу 1 см
пенициллина из четвертой пробирки (см. п.3.1.23), содержащей в 1 см
10 ед. пенициллина, тщательно перемешивают, получают агар, содержащий 0,5 ед. пенициллина в 1 см
, во вторую колбу вносят 1 см
из пятой пробирки (см. п.3.1.23), содержащей в 1 см
1 ед. пенициллина, получают агар, который содержит в 1 см
0,05 ед. пенициллина; третью колбочку оставляют без пенициллина для контроля. Содержимое всех трех колбочек разливают в стерильные пробирки по 5 см
в каждую и скашиваю
т.
3.1.25. Приготовление индикаторной бумаги для определения индола
5 г парадиметиламидобензальдегида, 10 см
очищенной концентрированной фосфорной кислоты растворяют в 50 см
96° спирта. В тепловатом растворе смачивают фильтровальную бумагу, высушивают, нарезают узкими полосками. Цвет бумаги - желтый. При наличии индола цвет бумаги меняется от сиреневато-розового до интенсивно малинового. Появление других цветов на индикаторной бумаге не учитывают.
3.1.26. Приготовление индикаторной бумаги для определения сероводорода
В 100 см
дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислого натрия. Этим раствором пропитывают полоски фильтровальной бумаги, высушивают их при температуре 18-23 °С и нарезают на узкие полоски. После приготовления бумага остается белой: при наличии сероводорода чернеет.
3.1.27. Приготовление насыщенного спиртового раствора метиленовой сини
В 100 см
96° этилового спирта растворяют 8-9 г метиленовой сини. Раствор фильтруют.
3.1.28. Приготовление водно-спиртового раствора метиленовой сини
К 30 см
дистиллированной воды добавляют 1 см
насыщенного спиртового раствора метиленовой сини, приготовленной по п.3.1.27.
3.1.29. Приготовление метиленовой сини Леффлера
К 100 см
дистиллированной воды добавляют 30 см
насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и 1 см
1%-ного раствора гидроокиси калия.
3.1.30. Приготовление насыщенного спиртового раствора фуксина
8-9 г основного кристаллического фуксина высыпают во флакон, заливают 100 см
96° этилового спирта и ставят на 18-24 ч в термостат с температурой 37 °С. Флакон периодически взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется, и на дне флакона остается осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.
Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла. Из насыщенного спиртового раствора готовят водно-спиртовой раствор фуксина. Для этого к 1 см
насыщенного раствора добавляют 9 см
дистиллированной воды.
3.1.31. Приготовление карболового фуксина Циля
1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты (фенола) и 0,5 см
глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см
96° этилового спирта. После того, как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см
дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
3.1.32. Приготовление карболового кристаллического фиолетового, генциан-фиолетового или метилового фиолетового для окраски по Граму
1 г кристалл-, генциан- или метилвиолета растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты (фенола). Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см
96° этилового спирта. После того, как краска полностью растворится, прибавляют при постоянном помешивании 100 см
дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Растворы нестойкие.
3.1.33. Приготовление красящей бумаги по Синеву
В 100 см
96° этилового спирта растворяют 1 г кристаллвиолета и 1 см
глицерина. Краску наливают в лоток. Бумагу нарезают полосками шириной 2,0-2,5 см и длиной 30-50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краску так, чтобы она окрасилась с обеих сторон. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на шпагате для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре 18-23 °С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2х2 см и хранят в банке из темного стекла.
3.1.34. Приготовление раствора Люголя
В 10 см
дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают 5-6 ч до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 см
дистиллированной воды. Хранят раствор в склянке из темного стекла.
3.2. Окраска препаратов
3.2.1. Окраска мазков по Граму (общепринятая модификация)
На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый генцианвиолет. Выдерживают 1-2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску, мазок промывают водой и наливают на него раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1-2 мин раствор сливают и наливают этиловый спирт на 0,5-1 мин. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают водным фуксином или водным раствором сафранина в течение 1-2 мин. Затем промывают водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.
Окраску по Граму можно применять в видоизменении Синева, согласно которому вместо карболового генцианвиолета применяют окрашенные полоски фильтровальной бумаги, приготовленной по п.3.1.33. Для окрашивания мазков на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором кристаллвиолета, и наносят две-три капли воды, которые полностью впитываются бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Выдерживают 2 мин, затем бумагу удаляют пинцетом и дальнейшую окраску производят по Граму.
3.2.2. Окраска капсул методом Ольта
Мазки окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина в течение 1-3 мин (лучше при подогревании) и быстро смывают водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением: сафранин растворяют в воде, доведенной до кипения и фильтруют через бумажный фильтр.
3.2.3. Окраска капсул методом Ребигера
Мазки окрашивают и фиксируют одновременно. Готовят раствор: 15-20 г генцианвиолета растворяют в 100 см
40%-ного формалина. Раствор оставляют на 8-10 ч при температуре 20 °С, фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированные мазки в течение 15-20 с, быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
3.3. Подготовка образцов к исследованию и проведение посева
3.3.1. Каждый представленный к исследованию образец (мышцы, лимфатические узлы, паренхиматозные органы) перед посевом освобождают от видимой жировой и соединительной ткани, погружают на 2-3 мин в спирт и два раза обжигают с поверхности. Затем стерильными ножницами из глубины различных мест каждого образца вырезают кусочки размером не менее 2,0х1,5х2,5 см; лимфатические узлы разрезают пополам. Затем все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами.
3.3.2. Для посева составляют две пробы по 15 г каждая. Одна проба состоит из кусочков мышц и лимфатических узлов, а вторая - из кусочков паренхиматозных органов (печени, почки и селезенки).
3.3.3. Каждую пробу в отдельности помещают в стерильный стакан (колбу) гомогенизатора для приготовления взвеси. Для этого в стакан (колбу) добавляют по 15 см
физиологического раствора, количество которого равно массе каждой пробы, и гомогенизируют пробы в электрическом гомогенизаторе. Вначале измельчают материал замедленной частотой оборотов, затем с большей частотой оборотов не более 2,5 мин (в зависимости от числа оборотов).
1 см
приготовленной взвеси содержит 0,5 г продукта.
3.3.4. Полученные взвеси отстаивают 10 мин. Из верхней части надосадочной жидкости пипеткой Пастера или петлей вносят на чашку с мясо-пептонным агаром и элективной средой (Эндо, Левина) одну-две капли или одну петлю и тщательно втирают материал в поверхность предварительно подсушенных сред.
3.3.5. Одновременно с посевом на плотные среды производят посев материала для накопления сальмонелл в одну из сред обогащения (селенитовый Ф-бульон, Мюллера, Кауфмана, Киллиана, хлористомагниевую среду "М"). Для этого 20 см
взвеси из мышц и лимфатических узлов вносят в один флакон (колбу), а 20 см
взвеси из паренхиматозных органов - в другой. В каждый флакон наливают по 50 см
среды обогащения.
При отсутствии гомогенизатора допускается посев кусочка пробы размером не менее 2,0х1,5х2,5 см (путем нанесения отпечатков разными сторонами пробы на поверхность питательной среды в чашках с предварительно подсушенным мясо-пептонным агаром и элективной средой Эндо, Левина). При этом необходимо произвести также посев на элективные среды из лимфатического узла печени или соскоба с внутренней стенки желчного пузыря. Посев в среду обогащения производят во флаконы Сокслета (колбы), в которые предварительно налито по 50 см
среды обогащения (селенитовый Ф-бульон, Мюллера, Кауфмана, Киллиана, хлористомагниевая среда "М"). В один флакон вносится измельченная проба из мышц и лимфатических узлов массой 10 г, а в другой - 10 г из паренхиматозных органов.
Следует иметь в виду, что на селенитовом Ф-бульоне S. typhi suis и S. cholerae suis, как правило, не растут. Наилучший рост S. cholerae suis наблюдается на среде Киллиана.
